Figur 1:Kromosomer och DNA.

Figur 2: Bilden illustrerar några viktiga storlekssamband inom genetiken. Det totala haploida genomet omfattar 3 miljarder baspar och enskilda kromosomer mellan 50 och 300 miljoner baspar. De flesta generna innehåller omkring 10 000 baspar, men variationen är enormt stor. Många geners transkript (mRNA) är omkring 1000 baser långa uppdelade i medeltal 9 exon vilka i regel är några hundratal baser vardera. Som framgår i mitten på bilden kan mutationer som orsakar sjukdom vara av mycket varierande storlek, även för till synes ganska närbesläktade tillstånd.

Sjukdomsframkallande mutationer kan vara alltifrån en enskild bas som bytts ut till att stora kromosomavsnitt saknas, finns i extra kopior eller har bytt plats. Symtom av en mutation avgörs inte av deras storlek utan av vilka konsekvenser den ger upphov till på proteinnivå. Således kan ett basparsutbyte helt förändra ett proteins struktur och leda till förändringar som är letala, medan en extra kopia av flera gener orsakad av en kromosomduplikation ibland kan ge ganska milda symtom.

Den arsenal av metoder som står till buds baseras på flera principiellt olika metoder. Vid cytogenetik används vävnadsodling för att stoppa cellerna i celldelningens metafas och sedan studera kromosomerna. Med FISH (fluoroscent in situ hybridisering) används molekylära metoder för att analysera celler på objektsglas efter att dessa hybridiserats till fluoroscentmärkta sonder. Man använder antingen metafaskromosomer eller icke delande celler (interfas) för att visualisera kromosomavsnitt som är mindre än vad kromosomernas bandmönster kan upptäcka. Upplösningen för FISH är c:a 50 000 baspar och upp till en hel kromosom (chromosome painting). Notera att cytogenetik och vissa FISH-analyser fordrar att levande celler odlas vilket ställer särskilda krav på provmaterialet.

Analyser av mindre genetiska förändringar i enstaka gener använder i stället DNA som kan isoleras ur till exempel vita blodkroppar, hudceller och även frusen vävnad. Isolerat DNA används även för att fastställa antalet genkopior som en screening av hela genomet med array-baserade analyser. Upplösningen är då beroende av antalet genprober som finns på den array som används. Southern-blot, en molekylär metod där DNA fragmenterats med restriktionsenzymer och storleksseparerats med elektrofores för att sedan hybridiseras till radioaktivt märkta sonder används för att detektera förändringar på 200 -300 baspar och upp till >50 000 baspar. Eftersom Southern-blot är en ganska komplicerad metod att utföra söker man ofta alternativ och metoden har därför minskat i betydelse på senare år. Med PCR kan man amplifiera genomiskt DNA i fragment som är upp till c:a 2000 baspar. Sedan kan dessa fragment analyseras på olika sätt för att identifiera mutationer. PCR är en enkel, robust och snabb metod, och det finns ett stort antal analyser för mutationsdetektion som baseras på denna metod. Ett exempel är MLPA (multiplex ligation probe amplification) som är en metod som möjliggör detektion av deletioner och duplikationer av olika storlek, från enstaka exoner till större kromosomregioner, vilket täcker mutationer i ett brett storleksintervall. De metoder som är inkluderade i figuren beskrivs mer utförligt nedan i detta kapitel.

Notera att när man analyserar konstitutionella mutationer är man inte beroende av vilken vävnad som används som provmaterial. De genetiska förändringar man letar efter finns i kroppens alla celler, och man kan hitta mutationer i till exempel blodceller trots att symtom uppstår i en annan vävnad långt senare i livet. Det är alltså möjligt att i ett chorionvilli-prov (moderkaksprov) fastställa om ett foster riskerar att utveckla en muskelsjukdom i vuxen ålder. Vid genetiska analyser är det vanligast att man analyserar blodprover, men fosterceller (amniocyter eller chorionvilli-prov), vävnadsodlade hudfibroblaster, EBV-transformerade B-lymfocyter och saliv som innehåller celler från munslemhinnan används också. I vissa situationer kan sparade prover användas, till exempel intorkat blod från neonatal screening (så kallade ”PKU-lappar”), blod eller benmärgsutstryk som sparats på objektsglas, frusna tumörbiopsier eller formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsklossar. Paraffinklossar utgör en stor biobank där det ofta återfinns material från avlidna personer, vilket kan vara av stort värde i släktutredningar. Tyvärr fungerar detta material inte alltid så bra för genetiska tester eftersom formalinbehandlingen kan ha degraderat DNAt så att den tekniska kvaliteten blir dålig.

Figur 5: Det dubbelstängade DNA templatet denatureras genom att värma reaktionen till 95°C (1). PCR primers tillåts baspara (annealing) till sin specifika målsekvens vid optimal temperatur (50-65°C) (2). I närvaro av termostabilt DNA-polymeras, syntetiska nukleotider, och buffert kan en komplementär DNA sträng bildas genom inkorporering av nukleotider och elongering av DNA strängen vid 72°C (3). Från en kopia av DNA templatet har man nu två kopior, där varje DNA molekyl består av en gammal och en nysyntetiserad DNA sträng. Reaktionen kan nu genomgå nästa cykel med denaturering, annealing och elongering, vilket resulterar i fyra kopior av DNA. Vanligen får reaktionen genomgå 25-35 cykler. (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

Analys av DNA-sekvens

Sjukdomsframkallande mutationer varierar från stora mutationer, där antalet kopior av en kromosom eller ett kromosomfragment är förändrat, ner till utbyten av enskilda baser (figur 2). Mutationer som är begränsade till enstaka baser upptäcks lättast med DNA-sekvensering eller olika riktade analyser som kan upptäcka sådana mutationer. Vid DNA sekvensering identifieras ordningen på baserna i ett DNA segment. Genom att jämföra med en referenssekvens från en frisk individ (databas) kan man avgöra om mutation finns eller ej. De flesta kliniska analyser begränsas till de proteinkodande delarna av en gen genom att man bara analyserar exonernas sekvenser och flankerande områden. DNA-sekvensering i klinisk diagnostik bygger på F Sanger metoden med bas-terminatorer (dideoxynukleotider)(figur 6).

Figur 6: Man gör först en PCR-amplifiering av det eller de exon som skall sekvenseras. Stora exon delas upp i flera mindre överlappande PCR-produkter. Sekvensreaktionen innehåller PCR-produkt (templat), sekvensreagenser, en primer (Forward eller Reverse för att syntetisera en sträng i taget), DNA-polymeras, fyra olika nukleotider, samt fyra olika dideoxynukleotider. De fyra dideoxynukleotiderna (terminatorerna) är flouresecensmärkta med var sin fluorofor, (A=grön, T=röd, G=svart och C=blå). Koncentrationen av terminatorerna är låg, så varje gång en nukleotid inkorporeras i den växande DNA strängen, finns en liten chans att det är en dideoxynukleotid, vilket sätter STOPP för syntesen. Resultatet blir ett antal DNA fragment som skiljer sig i längd med en nukleotid där den sista nukleotiden är fluorescensmärkt. (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

Figur 7: Efter sekvensreaktionen separeras syntesprodukterna på en DNA-sekvenator. Detta instrument har kapillärer fyllda med en gelmatrix genom vilket DNA separeras efter storlek (längd) med elektrofores. Till kapillärerna är en laserlampa och en CCD-kamera kopplade som gör att man kan detektera de fyra olika färgerna. Färgerna registreras elektroniskt och ordningen på färger (dvs nukleotider) sammanställs baserat på tiden det tog att passera detektorn. Denna tid är proportionell mot DNA-fragmentets längd och varje sådant fragment har en färg motsvarande sista inkorporerade nukleotiden (A= grönt etc). På så sätt får man fram ett sekvensdiagram där varje bas är representerad i tur och ordning. Vanligen kan man tillförlitligt läsa 300-600 baser i en sekvens. Denna sekvens exporteras därefter elektroniskt till ett dataprogram där kvaliteten på sekvensen kan utvärderas och jämföras med en känd sekvens. I klinisk rutin brukar man utföra en sekvensreaktion av varje sträng i DNA-molekylen (forward respektive reverse) och jämföra bägge strängarna mot den kända sekvensen. Vid pilen ses två olika baser, G och C, vilket betyder att i denna position har individen två genkopior med olika baser i denna position. (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

DNA-sekvensering i sin nuvarande form är robust och har en hög tillförlitlighet. Om man vid DNA sekvensering identifierar en sekvensavvikelse, det vill säga en bas i kurvan som tydligt avviker, är den tekniska tillförlitligheten mycket hög. Det svåra är att avgöra om den aktuella sekvensavvikelsen är sjukdomsframkallande. En mutation som leder till ett ”frameshift”, det vill säga en förskjutning av läsramen pga en insertion eller deletion, resulterar ofta i att ett nytt stop kodon uppkommer senare i sekvensen. Detta resulterar då i ett trunkerat, förkortat protein, och detta är då oftast patologent. Mutationer som gör att aminosyror byts ut kan också vara patogena, och beror på vilken aminosyra som försvunnit och vilken som ersatt, samt var i proteinet utbytet skett. Om man kan påvisa eller utesluta den identifierade mutationen hos sjuka respektive friska släktingar till patienten ger det ytterligare indikationer på att det är en sjukdomsframkallande mutation. Om den identifierade mutationen finns beskriven tidigare hos andra patienter med samma sjukdom styrker det att det är en sjukdomsframkallande mutation. Det finns databaser där rapporterade mutationer i olika gener sammanställts.

Om man vid screening av alla exon i en gen inte kan påvisa en avvikelse är det ändå möjligt att det föreligger en allvarlig mutation, eftersom DNA-sekvensmetoden har tekniska och biologiska begränsningar. Om man analyserar patienter med en ärftlig sjukdom som orsakas av mutationer i en specifik gen, upptäcker man med DNA-sekvensering vanligen mutationer i sjukdomsgenen i 70 - 90% av patienterna.


Det finns flera orsaker till att en mutation inte detekteras hos alla patienter:

1 En orsak är att mutationen inte ”ses”. Vid den ursprungliga PCR-reaktionen kan det vara så att endast den friska allelen amplifierats. Orsaken till detta kan vara att mutationen utgör en deletion av hela eller bitar av det amplifierade segmentet, inklusive primersekvensen. Vid en recessiv sjukdom där bägge allelerna har samma deletion, ses detta som avsaknad av PCR-produkt. Om bara en allel saknas kommer bara den friska allelen att amplifieras och sekvenseras varför deletionen i den andra allelen inte upptäcks. På liknande sätt kan det föreligga sekvenspolymorfier som gör att PCR-primrarna inte fungerar optimalt varför man kan missa en allel.

2 En annan viktig orsak är att den sjukdomsframkallande mutationen utgör en ovanlig ”splicevariant”. Den kan vara belägen i ett intron så att man introducerar extra baser i transkriptet. En annan orsak kan vara att en bas bytts ut i ett exon, vilket introducerar en ny splice-site, utan att man identifierar detta som en mutation. I den sekvensjämförelse som görs ser man ofta ”tysta” basparsutbyten som leder till att ett kodon ändras på DNA-nivå, men översatt till protein kodar detta kodon för samma aminosyra. Detta tolkas då som en polymorfi, men det är teoretiskt möjligt att denna förändring verkligen påverkar transkriptet genom att en ny splice-site introducerats.

3 En annan viktig felkälla som leder till att man inte hittar en mutation är genetisk heterogenitet vilket betyder att ett kliniskt tillstånd kan orsakas av mutationer i olika gener. Det finns många exempel på detta och om man inte hittar mutationer i en gen kan sjukdomen ha orsakats av mutationer i en annan gen.


Metoder för mutationsscreening

Eftersom behovet av analysmetoder för sekvensavvikelser varit stort och DNA-sekvensering ofta varit dyrt och tekniskt svårt har ett antal metoder som lämpar sig för screening av sekvensavvikelser utvecklats. Vissa av dessa används i klinisk rutin, till exempel heteroduplexanalys, dHPLC och DGGE. Gemensamt för dessa metoder är att de inriktats på att snabbt kunna screena många patienter och flera gener på bekostnad av att känsligheten oftast är lägre än med DNA-sekvensering. Med dessa screening-metoder kan man identifiera delar av en gen eller exoner som är avvikande jämfört med friska individer, men de kan inte påvisa sekvensavvikelsen. Ett positivt fynd vid en screeningmetod används för att välja ut vilken gen eller vilket exon man skall sekvensanalysera hos en viss patient. Metoderna används inte som enda metod för att analysera sekvensavvikelser i en gen utan misstänkta mutationer verifieras med sekvensering.


Riktade mutationsanalyser

För flera sjukdomar är mutationsspektra begränsat i den mening att en stor andel av alla patienter har en och samma eller ett fåtal olika mutationer. En strategi är då att sekvensera de berörda delarna av genen. Det är också vanligt att man designar ett test som förmår att detektera eller utesluta de vanligaste mutationerna med en enkel och snabb analysmetod.


Fragmentlängdsanalys – trinukleotidsjukdomar

Det finns ett 20-tal neuromuskulära sjukdomar som orsakas av instabila polymorfa trinukleotid repetitioner. En av dessa är Huntingtons sjukdom som orsakas av en expanderad CAG repetition. I ett exon i Huntingtin-genen upprepas baserna CAG, vilka kodar för glutamin. Friska individer har vanligen CAG upprepat 5-30 gånger (figur 8) medan patienter med Huntingtons sjukdom i stället har 40 eller fler CAG-repetitioner. Detta leder till en extra lång glutaminsekvens i proteinet Huntingtin vilket skadar celler i hjärnan som dör i förtid och därmed resulterar i sjukdomssymtom. Dystrofia myotonica orsakas av en förlängning av en polymorf CTG-repetition i sjukdomsgenen DMPK och vid Fragilt-X-mental retardation leder en förlängning av en polymorf CGG-repetition i FMR1-genen på X-kromosomen till sjukdomen. I dessa situationer kan man fastställa antalet trinukleotider hos en individ genom att använda PCR där primersekvenserna är homologa till den del av sjukdomsgenen som flankerar trinukleotidpolymorfin.

Fragmentlängdsanalys kan även användas för detektion av mindre deletioner. På så sätt kan man identifiera den vanligaste mutationen vid cystisk fibros, ∆F508, som är en deletion av tre baser i exon 10 av CFTR-genen. Denna mutation kan lätt identifieras med en PCR-reaktion och elektrofores av PCR-produkterna så att man kan se fragment med 3 basers längdskillnad.

Figur 8                                                                                                

Oligonucleotide ligation assay – OLA

 

Figur 9: OLA bygger på att två oligonukleotider kan ligeras samman om de är homologa och hybridiserar till intilliggande sekvenser. Antag att man vill testa för en mutation där basen C bytts ut mot T i en gen. Proben består då av en oligo (common probe) som hybridiserar till sekvensen direkt efter den aktuella basen. Den andra oligon hybridiserar till intilliggande sekvens och med den aktuella basen i 3’ änden. Man kan då välja om den oligon ska vara specifik för normal sekvens eller muterad sekvens. Man kan också syntetisera två olika oligos med olika längd, en specifik för normal sekvens och en specifik för muterad sekvens. Vid en hybridisering av dessa oligos samt efterföljande ligering kommer bara den oligonukleotid som är exakt homolog till templatet att resultera i en ligeringsprodukt, det vill säga antingen oligon specifik för mutationen eller oligon specifik för normal sekvens har ligerats till den gemensamma oligon. Om en ligering sker kommer produkten att hänga ihop som ett fragment. Produkterna separeras sedan med elektrofores, och produkter som innehåller C respektive T i den kritiska positionen kan särskiljas antingen genom olika längd och/eller olika fluoroforer (färger) som bundits till oligonukleotiden. På så sätt kan man fastställa om det DNA man analyserar har C eller T i den position man analyserar. Vid Oligonucleotide ligation assay (OLA) kan man testa för upp till 30 olika mutationer i en och samma reaktion. Steg ett är multiplex PCR amplifiering av de olika aktuella regionerna. En specifik probe för varje mutation tillsätts sedan till PCR produkterna. Varje probe består av tre oligonukleotider som hybridiseras till PCR produkterna, följt av ligering och storleksbestämning av ligeringsprodukter.

Figur 10: Bilden illustrerar hur man identifierar den vanligaste mutationen vid sickle-cell anemi. Först gör man en PCR-amplifiering av den eftersökta delen av genen och klyver med restriktionsenzymet. Klyvningsprodukterna separeras därefter med vanlig elektrofores på en agarosgel. Metoden har stor användning eftersom den är enkel och robust. Metoden är dock endast applicerbar om den aktuella mutationen är vanlig och utgör en betydande del av de förekommande mutationerna. Så är t.ex. fallet vid hemokromatos, akondroplasi och sickle-cell anemi.

Figur 11: Vid Southern-blot klyvs DNA med restriktionsenzym. De fragment som på så sätt uppstår separeras på en agarosgel och överförs med kapillärkrafter till ett membranfilter (engelska blotting - jämför läskpapper) som binder DNA. Detta filter har alltså alla de DNA fragment som uppkom med klyvningen separerade efter storlek. Nästa steg är att hybridisera en radioaktivt märkt genspecifik sond till filtret. Efter att överskottsprobe tvättats bort lägger man filtret på en röntgenfilm (autoradiografi) varvid radioaktiva restriktionsfragment framträder som band. (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

Figur 12. FISH-analys av metafaskromosomer. DNA sonder (Engelska: prober) kan märkas in direkt med fluorescent molekyl eller indirekt med en reportermolekyl (t ex biotin). Efter denaturering av metafaskromosomer samt denaturering av DNA sond kan dessa tillåtas hybridisera till varandra. DNA sonden binder till sin komplementära sekvens på kromosomen och efter tvätt, för att avlägsna överflödig sond, kan signaler detekteras via ett fluorescensmikroskop. Om sonden är indirekt inmärkt med reporter sker märkningen av fluorescens i efterhand via en molekyl som binder till reporter molekylen (t ex avidin).

Figur 13. FISH analys kan utföras på metafaskromosomer (a) såväl som på cellkärnor som befinner sig i interfas (b). I det senare fallet ser man inte de enskilda kromosomerna, men antalet signaler i cellkärnan kan ge information om antalet kopior av den aktuella regionen man undersökt. (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

Figur 14: MLPA inleds med att man, för varje målsekvens man vill testa, hybridiserar två specifika oligonukleotider till genomiskt DNA. Dessa två oligonukleotider binder till intilliggande sekvenser, och endast vid hel komplementaritet kan de ligeras ihop. De oligonukleotider man använder har dessutom i ytter-ändan en PCR primersekvens samt däremellan olika långa mellanliggande avsnitt (stuffer sekvens). Nästa steg är att man gör en PCR-reaktion med hjälp av fluorescensmärkta universella primers, då endast ligeringsprodukter kommer att amplifieras. Antalet PCR-produkter kommer att vara proportionellt till antalet ligeringsprodukter som i sin tur beror på antalet templatkopior. Eftersom samma primers kan PCR-amplifiera alla ligeringsprodukter, och man använder oligonukleotider med olika långa mellanliggande avsnitt (stuffer sekvens), är det möjligt att utföra flera ligeringsreaktioner samtidigt i samma rör (multiplexing). (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

Figur 15: Genom sådan ”multiplexing” kan man i samma reaktion analysera 40 (se kommentar ovan) olika loci (gener/exoner/sekvenser), där varje lokus ger en PCR produkt med specifik längd. PCR-produkterna separeras på en sekvenator och mängden PCR produkt för varje lokus kvantifieras och jämförs med resultat från friska kontroller. För varje ligeringsprodukt (probe) beräknas ett ratio jämfört med frisk kontroll och om ingen deletion eller duplikation föreligger hos patienten för denna specifika målsekvensen ligger den normala ration omkring 1.

Figur 16: Genomiskt DNA isoleras från patient respektive normal kontroll och inmärks med olika fluoroforer (patient DNA med grön fluorofor och normalt DNA med röd fluorofor). Dessa DNA-prov blandas i lika stor mängd tillsammans med Cot-1 DNA (som blockerar repetitiva sekvenser), och tillåts hybridisera till en sk array. Vid array-CGH används vanligen BAC-kloner med human insert  bestående av c:a 200.000 baspar genomiskt DNA. Dessa BAC-kloner kan ”spottas”, det vill säga sättas som små fläckar på ett objektsglas som sedan kan användas för att hybridisera mot. Färgförhållandet mellan grön och röd i varje ”spot” kan kvantifieras elektroniskt och på så sätt kan man identifiera om det föreligger en gendosavvikelse i patient DNA. Genom att välja BAC kloner med insert som överlappar litet får man sk ”tiling arrays” (jämför tegeltak). En tiling array med c:a 33.000 BAC-kloner innehåller således över 6 miljarder baspar och täcker därmed hela det humana genomet med i genomsnitt 2 kloner för varje del av genomet. Med CGH mot en tiling array kan man få en upplösning på ungefär 100.000 baspar, vilket skall jämföras med 10 miljoner baspar som är upplösningen vid rutinmässig kromosomanalys. I stället för BAC-kloner kan även oligonukleotider används, varvid arrayen innehåller fler prober. Principerna är dock densamma och upplösningen beror på antalet prober samt deras fördelning.

Figur 17: Ration mellan röd och grön i en punkt (en BAC klon) beräknas, och om patienten har två kopior av denna del av genomet kommer ration ligga mellan 0,8-1,2. Om patienten har en deletion kommer kloner som representerar denna region ha mindre grön inmärkning än röd, och ration blir då cirka 0,5. (Bildkälla: A Read & D Donnai, New Clinical Genetics, ©Scion Publishing Ltd)

Verktygslådan med metoder (figur 2) ger även möjlighet att identifiera viktiga förvärvade genetiska förändringar i maligna celler. Kromosomanalys är en viktig metod inom leukemidiagnostik eftersom olika typer av leukemier ofta har specifika avvikelser, translokationer mellan kromosomer, som relativt lätt kan ses i mikroskopet. Det finns dock betydande tekniska svårigheterna med cancercytogenetik, då analyser av malign vävnad är tekniskt och biologiskt mer komplicerat. Diagnostik av kromosomavvikelser i cancerceller kompliceras bland annat av att dessa förändringar är förvärvade, så att det finns en blandning av normala celler och celler med den specifika sjukdomsframkallande förändringen i provet man analyserar. Tumörspecifika translokationer kan även detekteras med molekylära metoder. Med FISH ses en fusion mellan olika kromosomspecifika sonder och med RT-PCR kan fusionstranskript detektera när två gener smälts samman. Vidare kan samtliga metoder som används för detektion av konstitutionella mutationer också användas för att påvisa förvärvade mutationer i cancerceller.


Analys av genuttryck

Det finns förvärvade tillstånd där kvantifiering av uttrycket av en viss gen kan vara av kliniskt intresse. Ett viktigt exempel är kvantifiering av leukemispecifika fusiongener som uppstår som en konsekvens av klonspecifika genetiska rearrangemang. Det finns ett flertal kliniskt relevanta fusionsgener, och den som har störst klinisk betydelse är fusionsgenen som uppstår vid rearrangemang mellan kromosom 9 och kromosom 22 . Nästan alla patienter med kronisk myeloisk leukemi (KML) bär på en translokation mellan den långa armen av kromosom 9 och den långa armen av kromosom 22. Denna translokation ger upphov till den så kallade Philadelphia kromosomen. Detta resulterar i en fusionsgen mellan BCR och ABL generna som uttrycks som RNA och fusionsprotein. FusionsRNAt kan användas som markör för leukemiceller och kvantifieras med realtids-PCR som är mycket känslig. Vid KML ser man endast fusionsvarianten kallad ”Major” (p210) som sammanför exoner BCR12 alt BCR13 med ABL2. Cirka 20% av vuxna patienter med akut lymfoblastisk leukemi (ALL) och cirka 5% av barn med ALL kan också bära på en translokation som resulterar i en Philadelphiakromosom. Av dessa har 2/3 den så kallade ”Minor” (p190) variantern, med fusion av BCR1 och ABL2 exonerna, medan resten har majorvarianten.

Figur 18: Bilden ilustrerar den för kronisk myeloisk leukemi karakteristiska genetiska avvikelse. A) visar en karyotyp med Philadelphiakromosomen,som en resultat av tranlokationen mellan den långa armen av kromosom 9 och den långa armen av kromosom 22. B) visar samma avvikelse med FISH sonder riktade mot ABL och BCR. C) panelen visar avvikelsen på molelylär nivå med fusionen av BCR och ABL generna som transkriberas i ett fusionsRNA och vidare translateras i ett fusionsprotein.

Figur 19: Modifierad efter Hughes et al. Figuren visar hur mängden leukemiceller minskar från diagnosen med behandling och känsligheten för olika metoder för remissionsbedömning, cytogenetik och kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR).

Figur 20: Figuren ilustrerar principen för realtids-PCR. PCR amplifieringen sker i närvaro av en tredje oligonukleotid, en s.k. hydroliseringsprobe, som är inmärkt med en flourofor i 3´ och en ”quencher” i 5´ändan och är komplementär till sekvensen mellan primrarna. Under PCR reaktionen hydroliseras proben av exonukleasaktivitet av Taq DNA-polymeras och fluorescensen ökar i takt med att PCR produkt akumuleras.