Ultraljudsundersökning
I Sverige erbjuds alla gravida kvinnor ultraljudsundersökning för att bestämma graviditetslängd, upptäcka flerbörd och systematiskt granska fostrets anatomi. Undersökningen har med tiden fått en ökad betydelse för upptäckt av fetala missbildningar hos kvinnor utan tidigare känd risk. Vid fynd av fetala missbildningar gör man vanligen en kromosomanalys av fosterceller (se nedan), eftersom upp till 30 % av missbildningar visar sig orsakas av en kromosomavvikelse, se nedan. I vissa fall kan det vara av vikt att få veta om ett foster har en missbildning utan att man för den skull avser att avbryta graviditeten. Man kan då optimera det obstetriska omhändertagandet genom att planera tidpunkten för förlossning, var den ska ske samt förlossningssätt. Det finns också ett fåtal tillstånd som med fördel kan behandlas prenatalt.
Screening för kromosomavvikelse
Det har länge varit känt att sannolikheten att få ett barn med trisomi 21 (Downs syndrom) ökar med stigande ålder hos modern. Notera att denna risk är högre vid tidpunkten för ett fosterprov än vid förlossningen eftersom flertalet foster med en kromosomrubbning spontant aborteras eller dör in utero senare under graviditeten. Denna kunskap ledde till att kvinnor över en viss ålder erbjöds fosterprov för kromosomanalys av fostret. Av födda barn med Downs syndrom har dock omkring två tredjedelar mödrar som är yngre än 35 år. Den relativt låga sensitiviteten när man använder moderns ålder som riskindikator för kromosomavvikelse, samt missfallsrisken vid fostervattenprovet, har lett till att nya urvalsmetoder har utvecklats. En fördel med att använda de nya urvalsmetoderna för att identifiera en riskgrupp är att antalet fosterprov och därmed associerade missfall blir lägre.
KUB - kombinerat ultraljud och biokemi
Den vanligaste screeningmetoden i dag är ett kombinerat test under graviditetsveckorna 10–14, s.k. KUB, en undersökning som används för att beräkna sannolikheten för att ett foster har trisomi 13, 18 eller 21. KUB omfattar ultraljudsmätning av fostrets nackuppklarning (Figur 3), två biokemiska serummarkörer i maternellt blod (fritt beta-hCG, humant koriongonadotropin och PAPP-A, pregnancy-associated plasma protein A) samt risken för trisomi 21 som betingas av moderns ålder. KUB ger en detektion (sensitivitet) för trisomi 21 på ungefär 86 % vid cirka 5 % positiva screeningstest i en oselekterad population. Fritt beta-hCG ligger i medeltal två gånger högre och PAPP-A i medeltal 40–50 % lägre vid graviditet med trisomi 21 jämfört med graviditet med normal kromosomuppsättning hos fostret

Figur 3: Mätning av nackuppklarning hos fostret (vitt streck) i graviditetsvecka 10-13. Notera vätskespalten i nacken (”NUPP”).
Resultatet av KUB är enbart en sannolikhetsbedömning. Ett test bedöms som positivt om resultat anger en risk att få ett barn med trisomi 21 som överstiger ett visst gränstal (”cut-off risken”, tex 1/200). Om man vill ha ett säkert besked om kromosomförändringar hos fostret måste man göra ett fostervattenprov eller moderkaksprov (ett diagnostiskt prov). Sensitiviteten för KUB anges till ca 85% för trisomi 21 och det positiva prediktiva värdet (PPV) till 5-10%. Dvs att om ens prov hamnar över gränsvärdet så är det maximalt 10% risk att fostret verkligen har en kromosomavvikelse. Därför erbjuds man vid positivt test ett moderkaksprov eller fostervattenprov. Ett alternativ till det invasiva provet är NIPT, se nedan.
KUB erbjuds i majoriteten av Sveriges landsting. Några landsting erbjuder undersökningen till alla gravida, och andra erbjuder den enbart till gravida kvinnor över en viss ålder, oftast 35 år.
Kromosomanalys
Sedan fosterdiagnostik för kromosomavvikelser introducerades i början av 1970-talet har denna baserats på en fullständig kromosomanalys och karyotypering av fostervattenceller, och senare även av moderkaksceller när moderkaksprov taget i första trimestern introducerades i mitten av 1980-talet. Kromosomanalys på odlade fostervatten- och moderkaksceller har en stor diagnostisk säkerhet, och metoden används därför rutinmässigt vid samtliga kliniskt genetiska avdelningar i Sverige och de flesta genetiska laboratorier utomlands där fosterdiagnostik bedrivs. Fullständig kromosomanalys kräver att cellerna odlas och därefter blockeras i metafasstadiet eftersom kromosomerna först då kan analyseras på ett tillfredsställande sätt med hjälp av olika kromosombandningstekniker (Figur 4, karyotyp). Med denna analys kan man påvisa numeriska kromosomavvikelser, sk aneuploidi, som tex en trisomi. Men även förlust eller tillkomst av kromosommaterial kan detekteras, förutsatt att de är av en storlek som kan detekteras vid mikroskopi. Kromosomanalys på odlade fostervattenceller har en mycket hög diagnostisk säkerhet på 99.4-99.8%. Även kromosomanalys på odlade moderkaksceller (korionvilli) har en hög diagnostisk säkerhet på 97.5-99.6 %.
Det tar som regel 11–14 dagar innan svaret på en kromosomanalys på fosterceller är klart. En väntetid som upplevs negativt av många par.

Figur 4: Human kromosomuppsättning (kvinnlig)
a) I varje cell i vår kropp finns en cellkärna och i den finns våra kromosomer. Kromosomerna innehåller i sin tur våra gener. Kromosomerna går inte att urskilja när cellen befinner sig i vilofas (se pil), men när cellen går in i delningsfas drar kromosomerna ihop sig och blir då synliga om man tittar i mikroskop.
b) Människan har normalt 46 kromosomer som kan delas in i 23 par. I varje par har vi ärvt den ena kromosomen från vår mamma och den andra från pappa. Det sista paret, könskromosomerna, skiljer sig åt mellan könen. Kvinnor har normalt två X-kromosomer, XX, medan män har en X och en Y kromosom, XY.
Riktad kromosomanalys för snabb analys avseende aneuploidi
För kromosomanalys tar det ungefär 14 dagar och ibland längre innan ett svar föreligger. Det finns ett önskemål från alla parter om ett snabbt svar vid fosterdiagnostik. Kvantitativ fluorescent polymeraskedjereaktionsteknik (QF-PCR) innebär molekylär amplifiering av repeterade sekvenser i olika polymorfa lokus på till exempel kromosom 13, 18, 21 samt könskromosomerna (Figur 5-6). QF-PCR på fostervatten- eller moderkaksceller tillåter ett svar inom 1-2 dagar för de vanligaste numeriska kromosomavvikelserna (trisomi 21, trisomi 18, trisomi 13 och könskromosomavvikelser). Denna metod identifierar således endast numerära avvikelser av dessa utvalda kromosomer och ibland mindre strukturella avvikelser på dessa kromosomer Avvikelser på andra kromosomer kommer inte att detekteras. Fördelen med QF-PCR är att metoden kräver en mindre mängd fosterceller, är mindre arbetskrävande därmed billigare än tidigare använda metoden interfas-FISH. QF-PCR har därför blivit rutinmetoden för snabbt svar på de vanligaste kromosomavvikelserna vid fosterdiagnostik. En annan fördel med QF-PCR analys är att man kan upptäcka maternell cell-kontaminering, vilket kan vara omöjligt att diagnostisera med kromosomanalys när fostret är kvinnligt.

Figur 5: Princip för QF-PCR. Pilarna i steg ett hänvisar till polymeraskedjereaktionsteknik.

Figur 6: Bilden visar resultatet för kvantitativ fluorescent polymeraskedjereaktion (QF-PCR) analys på fosterceller med tre olika polymorfa markörer på kromosom 21. De två (eller tre) topparna för respektive markör representerar var sin allel. Fosterprovet i övre raden visar två toppar för vardera markör, vilket motsvarar två stycken kromosom 21, d.v.s. normalt. Undre raden visar ett foster som har tre alleler för vardera markör (topparna antingen i förhållandet 1:1:1 eller i förhållandet 2:1), vilket betyder att detta foster har tre kromosom 21, dvs trisomi 21 (Downs syndrom).
Icke invasiv fosterdiagnostik (non-invasive testing, NIPT) för kromosomavvikelser
NIPT innebär att fosterdiagnostik kan göras utan att man behöver ta prov från moderkakan eller fostervattnet. Vid NIPT tas ett blodprov från den gravida kvinnan och analysen bygger på att det i blodet hos den gravida kvinnan finns en liten mängd cellfritt DNA (cfDNA) från fostret som kan användas för genetisk analys. Analys av cfDNA i ett blodprov kan användas för olika typer av fosterdiagnostik. I Sverige används metoden sedan många år för analys av fostrets blodgrupp. NIPT för diagnostik av kromosomavvikelser håller på att introduceras i Sverige. I detta avsnitt behandlar vi endast NIPT för kromosomavvikelser
Metod
Cellfritt DNA (cfDNA) finns i blodet hos oss alla som ett resultat av att celler bryts ner och nybildas. Under graviditeten sker det nybildning och nedbrytning av celler i moderkakan vilket leder till en frisättning av korta bitar cellfritt DNA från fostret till mammans blod. Under graviditetsperioden ökar mängden cellfritt DNA från fostret och från graviditetsvecka 10 är andelen cfDNA som kommer från fostret normalt 10-20%.
Från blodets plasma hos modern isoleras cellfritt DNA och efter ytterligare beredning och rening utförs massiv parallellsekvensering av DNA-provet. Resultatet består av flera miljoner korta ”läsningar” från samtliga kromosomer där en andel av läsningarna kommer från fostret. Om fostret har en trisomi (extra kromosom) för någon av kromosomerna som analyseras kommer det leda till en ökning av DNA-fragment från den kromosomen jämfört med ett antal referenskromosomer vilket möjliggör detektionen.
Vid NIPT för kromosomavvikelser kan blodprovet vanligen tas tidigast i graviditetsvecka 10+0 men denna gräns kan variera mellan olika laboratorier.
Faktaruta
Mer om metoden
Blodplasma innehåller cfDNA, det vill säga DNA som inte är bundet till cellkärnan. Hos gravida kvinnor härstammar en del av detta DNA från fostret (cellfritt fosterDNA, cffDNA) och denna del utgör också den så kallade fetala fraktionen av allt cellfritt DNA i blodbanan. CffDNA har sitt ursprung i celler från moderkakan och kan identifieras redan från graviditetsvecka fyra, dvs två veckor efter befruktningen. Från graviditetsvecka 10 så räknar man med att den fetala fraktionen hos en stor andel av de gravida har nått cirka 10 procent. Även hos de med en lägre fetal fraktion så har den i de flesta fall nått en nivå av >4 procent som brukar räknas som den lägre gränsen för att lyckas med NIPT för diagnostik av kromosomavvikelser. Därför rekommenderas NIPT vanligen från tidigast 10 fullgångna graviditetsveckor. Mängden cffDNA beror på flera faktorer. En av faktorerna som påverkar den fetala fraktionen är gravida kvinnans vikt där överviktiga kvinnor har ofta en lägre fetal fraktion än normalviktiga kvinnor. CffDNA består av relativt korta DNA-fragment men hela det fetala genomet finns representerat. Det har en kort halveringstid och är strax efter förlossningen inte spårbart, vilket ger en säkerhet att analysen gjorts på DNA från fostret i den aktuella graviditeten och inte på DNA från fostret i en tidigare graviditet.
Analysmetoden vid NIPT för kromosomavvikelser baseras på en utveckling av DNA-sekvenseringsteknologin, så kallad massiv parallell (shotgun) sekvensering (MPSS). Det är i dagsläget tre olika tillvägagångssätt som används kliniskt. Genom att märka det enskilda DNA-fragmentet möjliggörs sekvensering av flera prover samtidigt vilket är nödvändigt för att metoden ska bli mer kostnadseffektiv. Skillnaden mellan de olika metoderna ligger i vilka DNA-fragment som sekvenseras, det vill säga om man utför en generell analys av hela genomet eller en riktad analys av specifika kromosomer.
1) Massiv parallell (shotgun) sekvensering (MPSS). Miljontals DNA-fragment från hela genomet sekvenseras samtidigt och fragmenten matchas mot en etablerad referenssekvens för det humana genomet. Man kan därför knyta varje fragment till dess specifika kromosom. Antalet fragment från respektive kromosom jämförs sedan mot antal fragment för flera referensregioner i hela genomet för att få ett mått på överskottet. Om provet innehåller DNA från ett foster med trisomi 21 kommer det att finnas ett litet överskott av fragment från den kromosomen.
2) A. Riktad (targeted) massiv parallell sekvensering (t-MPS). Med hjälp av ett selektionssteg innan sekvenseringen kan man välja att endast sekvensbestämma fragment från de kromosomer som är av intresse, till exempel kromosom 13, 18 och 21. Man väljer då flera hundra regioner från varje kromosom som är extra lämpade för sekvensering. Liksom i exemplet ovan jämförs antalet fragment med referensregioner för att vid en trisomi detektera ett överskott av fragment från den kromosomen. Eftersom det totala antalet fragment som analyseras är lägre än vid MPSS blir metoden billigare både att sekvensera och analysera.
B. En annan form av riktad MPS använder förekomsten av enbaspolymorfismer i genomet, SNPs (eng. Single Nucleotide Polymorphisms). Vid SNP-baserad analys väljs fragment från dessa polymorfa regioner på de kromosomer som är av intresse. Flera tusen regioner per kromosom sekvenseras och jämförs med sekvenseringsresultatet från genomiskt DNA som istället isolerats från celler i mammans blod. Man kan då med större säkerhet få fram hur fostrets DNA-sekvens ser ut för dessa regioner och även se om det föreligger en förändring i antalet kopior av de fetala kromosomerna jämfört med mammans.
De ovan nämnda tillvägagångssätten har olika fördelar och nackdelar, till exempel vid graviditeter med speciella förutsättningar såsom vid tvillinggraviditet och äggdonation. I de allra flesta fall är dock metoderna i stort sett likvärdiga. Flest studier är gjorda med MPSS, följt av t-MPS och SNP-baserad analys. Det finns dock även andra metoder för analys av cffDNA som har utvärderats men ännu inte implementerats i klinisk diagnostik.
NIPT för kromosomavvikelser
NIPT används vanligen som en riktad analys för att påvisa trisomi 21 (Downs syndrom), trisomi 13 (Pataus syndrom) och trisomi 18 (Edwards syndrom). Testet kan också ge information om fostrets könskromosomer X och Y inklusive om det finns någon avvikelse i antalet könskromosomer, till exempel som vid Turners eller Klinefelters syndrom. Vad som ingår i analysen kan dock variera mellan olika laboratorier.
Hur säkert är testet?
Om NIPT-analysen visar på en kromosomavvikelse (ett positivt testresultat) betyder det att det finns en förhöjd sannolikhet för kromosomavvikelse hos fostret. Men detta måste bekräftas med ett fostervattenprov eller moderkaksprov eftersom avvikande resultat kan förekomma även om fostret är friskt (så kallat falskt positivt resultat). I dagsläget räknar man med att ca vart 5:e (20%) positivt prov är falskt positivt.
Om NIPT-analysen inte påvisar någon kromosomavvikelse är sannolikheten att fostret trots detta har en trisomi (så kallat falskt negativt resultat) mycket låg (ca 1 av 10 000 analyser för trisomi 13/18/21 beräknas vara falskt negativ).
Tvillinggraviditet: Av de sammanställningar som hittills gjorts så verkar NIPT fungera tillförlitligt även vid tvillinggraviditeter, men erfarenheten är fortfarande begränsad. Det går därför inte att utesluta att tillförlitligheten av NIPT är något lägre än det som anges för enkelbörd ovan.
Faktaruta
Säkerheten i NIPT-analysen
NIPT-metodens förmåga att korrekt identifiera fall med kromosomavvikelse är hög (metodens sensitivitet). För trisomi 21 är sensitiviteten över 99% och något lägre för trisomi 13 och trisomi 18. Falskt negativa resultat är mycket ovanliga, varför ett negativt NIPT-resultat i normalfallet inte föranleder någon ytterligare åtgärd. Även metodens förmåga att korrekt utesluta kromosomavvikelse hos foster är hög (metodens specificitet), 99% eller högre för alla trisomier. Trots hög specificitet så förekommer falskt positiva resultat. Sannolikheten att ett positivt testresultat verkligen är sant beror av andelen sant positiva resultat bland de testade och brukar anges som positivt prediktivt värde (PPV). PPV vid NIPT kan vara betydligt högre än 80% i en population gravida med förhöjd sannolikhet för trisomi och har i flera studier varit ner emot 50% i en population gravida med genomsnittlig sannolikhet för trisomi, vilket innebär att upp till vartannat positivt prov kan vara falskt positivt. Till följd av detta rekommenderas att ett positivt testresultat vid NIPT konfirmeras med invasiv provtagning och analys med QF-PCR eller kromosomanalys.
Vid bestämning av könskromosomerna, XX eller XY, ligger sensitiviteten på 98-99%. För könskromosomavvikelser finns ett mindre statistiskt underlag men sannolikt är sensitiviteten något lägre än för trisomi 21.
Var kan NIPT göras?
Alla landsting erbjuder inte NIPT och testet brukar endast erbjudas till vissa grupper, t.ex. gravida där KUB-undersökning visat ökad sannolikhet för kromosomavvikelse. I Stockholms läns landsting kan Klinisk Genetik, Karolinska Universitetssjukhuset ta emot prover för analys. Vissa privata mottagningar erbjuder NIPT mot en kostnad.
Länkar
SBU Alertrapport ”Analys av foster-DNA i kvinnans blod: icke-invasiv fosterdiagnostik (NIPT) för trisomi 13, 18 och 21” http://sbu.se/sv/Publicerat/Alert/Analys-av-foster-DNA-i-kvinnans-blod-icke-invasiv-fosterdiagnostik-NIPT-for-trisomi-13-18-och-21/
Svensk Förening för Obstetrik & Gynekologi (SFOG) ”Riktlinjer för fosterdiagnostik med NIPT, "non invasive prenatal test" https://www.sfog.se/start/rad-riktlinjer/sfog-riktlinjer/
Tidigare barn med kromosomavvikelse
Upprepningsrisken för föräldrar som tidigare fått ett barn/foster med trisomi 21 är oberoende av ålder numeriskt sett låg (0,5 –1%). För andra icke nedärvda kromosomrubbningar som trisomi 13 eller trisomi 18 är upprepningsrisken betydligt lägre (<0,5%).
|